近日，南京農業大學園藝學院汪良駒教授團隊研究論文《Transcription factor MdNAC33 is involved in ALA-induced anthocyanin accumulation in apples》在國JIZHU名期刊《Plant Science》上在線發表。該研究探討了NAC轉錄因子參與ALA誘導蘋果花青苷積累的分子機制，為ALA在GAO品質蘋果生產上推廣應用提供了新的理論依據。

研究背景

  5-氨基乙酰丙酸（ALA）是一種新型天RAN植物生長調節物質，能夠促進多種果實花青苷積累。然而，其潛在的機制仍然不清楚。在先前的一項轉錄組研究中，我們發現多個轉錄因子（TFs）在ALA誘導蘋果花青苷積累過程中具有重要作用。在本研究中，我們專門探究了蘋果NAC轉錄因子MdNAC33與ALA誘導的蘋果花青苷積累的關系，并且運用多種分子生物學手段，解析了MdNAC33調控ALA誘導花青苷積累的分子機制。

研究內容

1.ALA正向調控蘋果MdNAC33的表達

  蘋果果實在光照下果皮花青苷含量不斷上升，其間MdNAC33表達量上升；若用外源ALA處理，則果皮花青苷積累更多，同時，MdNAC33表達量也上升更多，說明MdNAC33與ALA促進的花青苷積累存在正相關關系。我們克隆MdNAC33上游2000bp啟動子序列，并連接到GUS報告基因上游，瞬時轉化蘋果葉片，并用ALA處理。結果發現，ALA處理顯著提高MdNAC33啟動子的轉錄活性，說明MdNAC33可能參與ALA誘導的蘋果花青苷積累。

2.MdNAC33參與ALA誘導的花青苷的積累

  為了明確MdNAC33在ALA誘導的蘋果花青苷積累中的作用，我們構建MdNAC33超表達與RNAi干擾表達載體，并通過農桿菌轉化法瞬時轉化至蘋果果皮或葉片，或者穩定轉化至‘王林’蘋果愈傷組織。結果發現，無論是哪個體系，超表達(OE-)MdNAC33均能顯著提高蘋果中花青苷含量，同時ALA具有增效效應；而干擾(RNAi-)MdNAC33表達后，則蘋果花青苷含量顯著降低，且ALA能緩解這種抑制效應。此外，RT-qPCR檢測發現，MdbHLH3、MdDFR和MdANS在轉基因蘋果中的表達量發生明顯變化，暗示著這些基因可能作為MdNAC33下游靶基因，共同參與蘋果花青苷合成調控。

圖2. MdNAC33參與ALA誘導蘋果花青苷的生物合成的功能分析

3.MdNAC33與MdbHLH3、MdDFR和MdANS的啟動子結合并激活其轉錄

  由于MdbHLH3、MdDFR和MdANS在轉基因蘋果中的相對表達量出現明顯變化，猜想，MdNAC33可能通過激活這些基因的表達來調節花青苷積累。于是，我們克隆了這些基因上游2000bp的啟動子區。通過酵母單雜（Y1H）發現，MdNAC33可以與MdbHLH3、MdDFR和MdANS啟動子結合。EMSA實驗也證明了這種結合。同時，我們開展雙熒光素酶及GUS報告基因實驗，證明MdNAC33可以激活MdbHLH3、MdDFR和MdANS的啟動子。其中，MdNAC33轉錄激活的MdbHLH3可以促進MdDFR和MdUFGT轉錄，而MdNAC33轉錄激活的MdDFR和MdANS也促進花青苷合成。

圖3. Y1H及EMSA證明MdNAC33與花青苷合成和調控相關基因啟動子結合

4.MdNAC33與MdMYB1互作，促進花青苷合成與積累

已知MBW (MdMYB1、MdbHLH3、MdbHLH33、MdTTG1)蛋白復合物在蘋果花青苷合成調節中發揮重要作用。為了檢驗MdNAC33與這些傳統轉錄因子的關系，我們進行Y2H、LCI和BiFC實驗。結果表明，MdNAC33與MdMYB1互作，并通過后者來上調MdUFGT和MdGSTF12表達，從而促進花青苷合成與積累。

圖4. MdNAC33與MdMYB1的互作分析

綜上所述，我們發現MdNAC33在ALA誘導蘋果花青苷積累中起到關鍵作用。基于此，我們提出MdNAC33參與ALA誘導蘋果花青苷積累的模型。首先，ALA處理上調MdNAC33表達。然后，MdNAC33通過三種方式來促進花青苷合成與積累。一，直接激活MdDFR和MdANS表達；二，直接激活調節基因如MdbHLH3，進而上調結構基因如MdDFR和MdUFGT表達；三，與轉錄因子MdMYB1互作，增強MdMYB1與靶基因結合，促進MdUFGT和MdGSTF12表達，最終，使得ALA處理后的蘋果花青苷積累顯著增加。本研究結果為ALA調控蘋果花青苷積累提供了新的理論證據。

作者簡介：

      論文DI一作者為南京農業大學果樹學博士生張留孜，通訊作者為汪良駒教授、仲巖副教授。科研助理張建婷、碩士畢業生魏波、碩士研究生李亞格和方項博士在試驗研究以及論文撰寫過程中也發揮了重要作用。

     汪良駒教授是江蘇省植物生理學會植物生長物質與生長調控ZHUAN業委員會主任。他于2000年起開始從事ALA在農林作物抗逆增產提質效應及其生物學基礎研究。其研發的產品“金村秋”、“禾稼春”和“秀果美”等已經大面積應用于QUAN國20多個省市區農業生產區。其團隊先后獲得20多項政府專項資金資助，在國內外學術期刊發表與ALA有關研究論文100余篇，GUO家授權專利20余項，處于5-A農業領域研究前沿。

資助基金：

江蘇省農業自主創新資金重大項目——CX(20)2023

國JIA自然科學基金——32172512，31772253

江蘇省碳達峰碳中和前沿基礎項目——BK20220005

江蘇省高校優勢學科項目

閱讀文章：https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2023.111949